高效液相色谱柱大致可分为五类:
一、高效反相液相色谱柱
以C18为代表的高效反相液相色谱柱一直被描述为药物发现、开发、方法验证(validation)的心脏! 高效反相液相色谱柱也极其广泛应用在药物代谢及动力学、生命科学、医疗健康、生物分析检测、毒品和兴奋剂检测、食品安全分析、环境分析、军事、国土安全等领域! 高效反相液相色谱制备柱也是最重要的分离纯化技术之一!
无论是过去，现在和可预见的未来, 以球形B型硅胶(5um 或 3um)为材料骨架的高效反相液相色谱柱在实际应用中永远占有统治地位!
常规HPLC方法的开发几乎总是从C18作为出发点，反相色谱占了80%以上的应用。
过去数十年来, 无数努力集注于:
1) 改善硅胶的品质, 优化键合化学;
2)开发新颖的材料骨架替代硅胶。
第二个战略发展方向是被证明是不成功的。正确的方向应集中在改善硅胶的品质, 优化键合化学: 第一个战略发展方向!
十多年前, 使用有机硅材料取代无机硅材料作为起始原料生产球形硅胶代表一个划时代的革命! 生产的球形硅胶命名为B型球形硅胶。无机A型硅胶重金属含量很高, 硅胶表面若干位置严重酸化及螯合效应等导致许多碱性化合物回收率低。球形B型硅胶重金属含量很低, 在非常大的程度上消除了A型无机硅胶表面若干位置严重酸化及螯合效应等问题。用B型球形硅胶合成高效液相色谱填料, 导致高效液相色谱柱产品质量有质的飞跃!
然而，另一方面，基于客户的大量反馈和我们对几乎所有色谱厂商产品的评估, 我们相信键合化学问题没有获得很好的解决。具体体现在:
(1) “纯粹”反相机理的键合相例如C18和C8市场上仍然是单功能，三功能和聚合物键合相"鱼目混杂"。即使是同一个色谱厂商, 也供应同一硅胶C18键合相的单功能和三功能键合产品, 显示色谱厂商没有足够的信心。另一原因是大多数色谱厂商单功能键合相键合密度偏低。
正确的方向是单功能键合。好的键合化学可以确保高的键合密度(请参阅我们每个键合相的技术参数), 也确保键合相在实际使用中无渗漏。单功能键合产品批次之间的差别小于3%(传统工艺这一指标为10%), 上游产品质量的高标准将确保下游定量分析的准确性和重现性。以C18为代表的高效反相液相色谱柱一直被描述为药物发现、开发、GLP/GMP方法验证(validation)的心脏!
三功能C18氯硅烷不是所有氯都和硅醇基反应。氯和相应水解产生的硅醇基比硅胶本身的硅醇基更酸性, 许多碱性化合物拖尾更严重。即使双功能C18氯硅烷也有相当多氯没有和硅醇基反应。
双功能, 三功能或聚合物键合机理复杂, 可变参数相当多, 键合产品批次之间的差别比较大, 使简单的问题复杂化。
(2) 键合相封端问题没有获得很好的解决, 一直是困扰色谱领域最大的问题! 迄今为止全部的尝试只获得有限的成功。
事实上, 固-液回流下的封端是一个死胡同, 不管什么样的催化剂和封端试剂被使用。这是因为封端试剂在固-液回流状态下很难扩散到硅胶的一些小孔内部, 因此无法封闭相应的酸性硅醇基, 色谱中体现为许多碱性化合物拖尾严重。用同一厂商同一工艺生产的不同孔径和不同粒径的B型球形硅胶, 用同一键合化学生产的C18键合相最能够体现这一点。一般来说, 大孔硅胶C18键合相酸性硅醇基效应(例如300Å C18)明显小于相应的中孔硅胶200Å C18键合相, 中孔硅胶200Å C18键合相酸性硅醇基效应明显小于相应的小孔硅胶100Å C18键合相。150 Å能被考虑作为一个分水岭, 小于150 Å孔径的高品质C18键合相是比较稀少的。此外, 一般来说, 同一孔径B型球形硅胶, 用同一键合化学生产的C18键合相, 10um粒径键合相酸性硅醇基效应明显小于5um粒径键合相。5um粒径键合相又明显小于3um粒径键合相。这是因为球形硅胶是由二氧化硅纳米粒子聚合而成。3um粒径硅胶孔隙明显小于5um粒径硅胶, 封端试剂在固-液回流状态下很难扩散到硅胶的一些小孔内部, 因此无法封闭相应的酸性硅醇基。
Chrom-Matrix公司创造性地提出和制定了一个成熟的超临界流体封端技术, 用于最大程度消除硅醇基的酸性效应。在本手册中所有反相高效液相色谱产品都使用Chrom-Matrix公司独一无二的超临界流体技术封端。从基础科学的观点, 超临界流体封端应该是最终版本的封端技术, 因为在超临界流体状态下, 扩散系数是固-液回流状态的1000倍, 封端试剂能充分扩散到硅胶的所有小孔内部而且通过化学反应最大程度封闭活性硅醇基。理论上, 这种方式几乎是唯一的可行性。
目前Chrom-Matrix公司在世界上是独一家使用超临界流体封端技术的公司。我们的所有反相高效液相色谱产品无论是基于客户的大量反馈还是我们自己的评估, 无论是理论分析还是实际应用, 都证明业界领先!
(3) 极性嵌入式(Polar embedded)键合相
极性嵌入式(Polar embedded)键合相是C18高效反相液相色谱"卫星群"中最重要的产品, 是C18和C8键合相最重要的补充。
极性嵌入式(Polar embedded)键合相起源于Supelco ABZ。Supelco ABZ的键合方法是用aminopropyl键合相和长链羧酸缩合反应形成一个C16酰胺。这个键合相对碱性化合物具有良好的峰形, 但很明显是以牺牲酸性化合物和两性化合物峰形为代价, 因为aminopropyl键合相的NH2功能团不可能完全反应, 键合相在酸性pH值下表面电荷为正。需要说明的是, 市场上几个所谓的C18就是使用携带正电荷的键合或封端试剂生产的, 通过非水溶液电位滴定查看得非常清楚: 这一战略不可接受。
从ABZ起头, Supelco充分认识到上述战略的副作用, 因此首先使用氨丙基硅烷合成C16酰胺硅烷, 然后键合到B型球形硅胶上, 这就是Supelco著名的Discovery® Amide。
由于没有专利保护, 其他色谱厂商踊跃模仿, 最终形式以酰胺或酰酯作为代表的极性嵌入式(Polar embedded)键合相群。
极性嵌入式(Polar embedded)键合相是C18和C8键合相最重要的补充: (3.1) 它们的选择性独特。换言之, 一些在C18和C8键合相上困难的分离可能在极性嵌入式(Polar embedded)键合相上获得很好的解决。许多成功案例! (3.2) 在相同条件下, 合格的酰胺极性嵌入式键合相比相应的C18键合相对碱性化合物有更好的峰形, 因为酰胺和碱性化合物有极性-极性（电荷转移）的相互作用, 客观上部分屏蔽了酸性硅醇基效应。
(3.3) 合格的酰胺极性嵌入式键合相能够在100%水相条件下使用, 而且比所谓的水相C18稳定得多。合格的酰胺极性嵌入式键合相和亲水色谱键合相让所谓的水相C18没有任何生存价值。
那么市场上的极性嵌入式(Polar embedded)键合相群的主要问题是什么? 极性嵌入式键合相和所谓的水相C18主要问题是键合相泄漏, 键合相不稳定等。两者之间的内在差异是: 极性嵌入式键合相键合相泄漏和键合相不稳定等问题能够获得很好的解决, 但使用极性硅烷试剂封端的所谓的水相C18键合相键合相泄漏和键合相不稳定等问题是不可逆转的。
在类似C18链长度的硅烷试剂中嵌入极性酰胺或酰酯, 使得键合相亲水, 在100%水相条件下稳定。但按照类似C18的键合化学, 键合覆盖率低, 键合相不稳定。
Chrom-Matrix InnovationTM PEG键合相是非常极性的产品, 但测试结果表明: PEG键合相非常稳定, 在LC-MS测试中没有检测到泄漏。这一成功和我们在胶体与界面科学领域的长期经验帮助我们成功开发了新型催化条件下新的键合化学。加上超临界流体技术封端, Chrom-Matrix InnovationTM 极性酰胺或酰酯键合相比那么市场上的极性嵌入式(Polar embedded)键合相群稳定得多。色谱柱产品质量和寿命有质的飞跃! 即使这样, LC-MS测试显示: Chrom-Matrix InnovationTM 极性酰胺或酰酯键合相仍然有非常低的泄漏。
(4) 无泄漏低孔和高比表面积C18键合相等是小分子化合物分离纯化的终端保证!
制备型高效反相液相色谱柱, 制备型高效正相液相色谱柱, 制备型高效离子交换色谱柱和对应的闪光色谱(flash chromatograpy) 是小分子化合物分离纯化最重要的终端保证!
几乎所有色谱厂商将他们的所有色谱产品装成制备型色谱柱推销。
但是市场上大多数色谱产品和闪光色谱(flash chromatograpy)键合相有明显的泄漏。尽管泄漏在紫外可见检测器中是看不见的, LC-MS信号非常明显! 最重要的是泄漏的硅烷实实在在洗脱到顾客的终端纯化产品中, 而且没有考虑在内。
使用有泄漏的键合相装成的色谱柱做分析没有大的问题!
使用有泄漏的键合相装成的色谱柱或对应的闪光色谱做前中期分离纯化没有问题, 但最后必须使用B型球形硅胶合成的无泄漏色谱柱或对应的闪光色谱做终端纯化!
非常明确的是: 用低孔和高比表面积B型球形硅胶合成的无泄漏色谱柱或对应的闪光色谱比中孔和中等比表面积B型球形硅胶合成的同类产品柱载容量大得多!
Chrom-Matrix公司成功地解决了上述所有问题! InnovationTM所有反相高效液相色谱产品都使用B型球形硅胶合成, 使用最优化个性化合成工艺, 使用超临界流体封端, 使用LC-MS/MS和表面电荷滴定等多种独特技术配合多种色谱测试保证产品的品质和批次重现性。其中大部分产品LC-MS/MS测试无泄漏, 极性嵌入式(Polar embedded)键合相非常低的泄漏。
二、高效正相液相色谱柱
正相液相色谱是最早的色谱模式。直到现在, 合成后通过硅胶柱做进一步纯化仍然是有机化学家日常工作的一个重要组成部分。在理论上, 几乎所有的溶于正己烷，乙酸乙酯或异丙醇的有机化合物都可以用高效正相液相色谱分析。但在实际应用中，高效正相液相色谱的应用比高效反相色谱少得多。这是因为正己烷, 乙酸乙酯没有像水，甲醇或乙腈那样受欢迎。此外, A型硅胶正相液相色谱给客户一个惯性思维: 高效正相液相色谱的平衡时间很长。
事实上, 高效正相液相色谱在制备规模的色谱纯化中一直发挥了重要作用。这是因为:
(1) 高效正相液相色谱比高效反相色谱柱压低得多。
(2) 高效正相液相色谱用的溶剂例如正己烷, 乙酸乙酯很容易通过旋转蒸发除去。
(3) 吡咯等蒸发性溶剂彻底改善了碱性有机化合物在B型球形硅胶, Diol和PEG正相液相色谱柱上的峰形。
此外, 不管制备规模或分析测试,
(1) 结构异构体分离分析必须使用正相液相色谱或超临界流体色谱。
(2) 环境中腐殖酸的结构鉴定必须使用甲基化或硅烷化消除小分子聚集, 然后使用正相液相色谱或超临界流体色谱。这种小分子聚集的自然现象一定相当广泛。
PEG正相液相色谱键合相等将让客户重新评估高效正相液相色谱的价值。
三、高效亲水液相色谱柱
高效亲水液相色谱是一个介于正相和反相高效液相色谱之间的运作模式。这个模式最早来自NH2色谱柱的糖分析应用。在此之后，逐步在Diol, 硅胶和亲水性高分子键合相找到了一些有价值的应用。
近年来，高效亲水液相色谱成为比较流行的色谱的运作模式, 主要是因为亲水性化合物有良好的保留和高效亲水液相色谱在LC-MS/MS中的应用。
尽管如此，迄今为止没有权威的论文, 评论和教科书揭示了高效亲水液相色谱真正的价值和局限性。
近年来，我们帮助客户采用高效亲水液相色谱的运作模式成功地开发和验证了数以百计的HPLC和LC-MS/MS应用。我们总结出:
(1) 高效亲水液相色谱是LC-MS/MS应用的第一选择。请参阅我们的LC-MS/MS产品手册应用案例。
(2) 除了InnovationTM TX多功能色谱柱, 所有亲水液相色谱仅可用于分析，而不是制备规模的分离。
(3) 高效亲水液相色谱流动相A是乙腈(pH值用少量的甲酸或其他调节), 流动相B是水(pH值用少量的甲酸或其他调节)。化合物洗脱秩序类似于正相液相色谱, 疏水性化合物首先洗脱, 然后是亲水化合物。流动相A一般不使用甲醇或丙酮或其他有机溶剂。
(4) 进样体积太大会导致一些峰值扭曲或分裂。柱承载能力通常是非常小的。
(5) InnovationTM TX, HP Amide, Silica三种高效亲水液相色谱覆盖99 ％以上的应用, NH2色谱柱用于简单糖分析应用。
(6) 除了InnovationTM TX多功能色谱柱, 所有亲水高效液相色谱柱柱效不如正相和反相高效液相色谱。
四、高效强阳离子交换液相色谱柱
离子交换液相色谱是生物分离最常见最有用的一种色谱模式。另一方面，小分子分离分析极少使用高效离子交换液相色谱。这是因为:
(1) 新颖的反相和多功能键合相例如InnovationTM Polar-Embedded Stable Amide和TX连续出现, 在很大的程度上补偿了常规C18键合相的缺点。 C18, C8键合相也有重大进展。高效亲水液相色谱柱也覆盖了许多分析应用。
(2) 相比之下, 硅胶基质的高效离子交换键合相近几十年来产品质量没有取得质的突破。硅胶基质的高效离子交换键合相柱寿命普遍短, 疏水相互作用明显。
(3) 聚合物基质的高效离子交换键合相在生物分析上面的应用比较广泛, 但其柱效过低，表面积太小，对小分子分离分析难有吸引力。
科学发明往往来自现实世界的挑战! 在对海洋毒素, 微生物代谢产物和天然植物(包括中草药)有效成分的分离纯化过程中, 我们深深感到高质量的硅胶基质的高效离子交换键合相是必不可少的! 因此，我们开发了硅胶基质的SCX, WCX, DEAE和SAX高效离子交换键合相。
五、InnovationTM高效多功能液相色谱柱
我们介绍四种高效多功能液相色谱柱:
(1) InnovationTMTX毒品分析HPLC柱
InnovationTM TX毒品分析HPLC柱是实际应用中最有价值的一种色谱柱。由于其在毒品分析上出色的表现, DEA专家称它毒品分析HPLC柱。InnovationTM TX是一个多功能色谱柱, 具有反相, 弱阳离子离子交换, 亲水等作用, 能够使用在100%水相或100%有机相。由于它的弱阳离子离子交换机理, InnovationTM TX对碱性化合物的分离效果是所有色谱柱中最好的。它对碱性化合物有完美的峰形。
它的绝对柱效和反相色谱分析柱相同的，甚至优于反相, 远胜传统的亲水色谱分析柱。
(2) InnovationTM DNPH HPLC柱
InnovationTM DNPH HPLC柱主要用于环境中醛和酮DNPH衍生物分析。在特定的DNPH衍生物分析应用中, 任何其他色谱柱没有它优越的选择性。
(3) InnovationTM PAH HPLC柱
(4) 血浆，血清直接进样的InnovationTM PEG色谱柱
限制进入键合相(Restricted access media)最早由Merck公司发明。一个典型的方法是首先制造Diol键合相, 然后通过酰酯或酰胺反应嵌入疏水链。硅胶外表面的酰酯或酰胺链使用酶切断开。但酶不能扩散到内表面。由此外表面亲水, 内表面疏水。血浆，血清, 尿样可以直接进样。蛋白质等生物流体通过亲水外表面时没有保留, 小分子化合物可以扩散到内表面通过反相保留最后洗脱。限制进入键合相(Restricted access media)在学术领域比较欢迎, 但随着固相萃取产品的发展, 在工业领域的应用相当少。
但我们最后发现, 血浆，血清, 尿样可以直接进样的限制进入键合(Restricted access media), 尤其是InnovationTM PEG色谱柱在药物代谢领域具有独特价值。药物代谢研究, 尤其是全盲条件下的早期药物代谢研究, 追求绝对回收率! 一种药物代谢之后, 打破成许多小分子化合物。全盲条件下不可能使用固相萃取回收全部小分子代谢产物。最理想的方法是, 血浆，血清, 尿样可以直接进样, 每毫升收集液使用14C同位素检测, 然后建立一个明确的代谢概况。
InnovationTM PEG色谱柱是一种多功能色谱柱。它是最好的正相色谱柱! 同时，使用乙醇取代储存溶剂后, 它能够被用来作为反相让血浆，血清, 尿样可以直接进样。 |
